【广东会GDH基因检测】结直肠癌基因检测明确患者癌症的与众不同

肿瘤基因解码基因检测如何增加检测的准确性？

肿瘤基因解码发现RNF43基因的功能缺失突变通过稳定Frizzled受体而诱导Wnt配体依赖的Wnt/β-catenin信号通路的激活,这种情况常见于由齿状息肉腺瘤发展而来的微卫星不稳定(MSI)型结直肠癌(结直肠癌(CRC))中。然而,RNF43突变如何促进肿瘤发生的机制对基于数据库比对的基因检测来说还不清楚。在肿瘤致病基因鉴定基因解码中,结直肠癌基因检测建立了9个人类结直肠癌(CRC)来源的类器官,发现其中3个类器官系携带与MSI-高和BRAF V600E突变相关的RNF43移码突变,表明这些结直肠癌(CRC)是通过锯齿状通路发展而来的。RNF43移码突变的类器官需要Wnt配体和R-spondin来增殖,这表明R-spondin对ZNRF3的抑制和保留的RNF43功能是实现肿瘤发生所需的不可或缺的Wnt激活水平的必要条件。然而,RNF43突变类器官中的活性β-catenin水平低于APC双击突变的结直肠癌(CRC),这表明通过锯齿状通路发展的结直肠癌(CRC)具有较低的Wnt激活阈值。有趣的是,将RNF43突变的类器官与肠道肌成纤维细胞一起移植加速了异种移植瘤中β-catenin的核积累和增殖,表明基质细胞在促进RNF43突变结直肠癌(CRC)细胞的恶性表型中起关键作用。对亚克隆类器官细胞表达转录本的测序显示,两个类器官系携带单等位基因RNF43顺式突变,即两个RNF43移码突变引入同一等位基因而野生型RNF43等位基因保留,而另一个类器官系携带双等位基因RNF43反式突变。这些结果表明,杂合RNF43移码突变通过锯齿状通路促进结直肠癌(CRC)发展;然而,与单击突变相比,第二次RNF43突变可能通过进一步激活Wnt信号而在肿瘤发生中更具优势。最后,PORCN抑制剂治疗显著抑制了RNF43突变细胞来源的PDX肿瘤发展。这些结果揭示了RNF43突变相关结直肠癌(CRC)发展的新机制,以及Wnt配体抑制对RNF43突变结直肠癌(CRC)的治疗潜力。

结直肠癌基因检测明确患者癌症的与众不同关键词

RNF43、锯齿状通路、结直肠癌、类器官、Wnt配体、PORCN抑制剂

肿瘤基因解码为什么要关注结直肠癌基因检测的全面性？

Wnt信号通路在成体组织干细胞的维持中起作用，这一过程由破坏复合物调控，其中GSK3磷酸化β-catenin，导致β-catenin通过泛素-蛋白酶体途径降解。Wnt信号也在受体水平受到调控；即E3连接酶RNF43和ZNRF3通过泛素化Wnt受体Frizzled（FZD）来下调Wnt信号，导致其周转。小鼠遗传学肿瘤遗传性与靶向药物基因解码表明，同时破坏肠道中的Rnf43和Znrf3会导致Wnt配体独立生长和通过Wnt信号激活发展成肠道肿瘤。

与此一致，在约18%的结直肠癌（结直肠癌(CRC)）病例中发现了RNF43的遗传改变。RNF43突变也在卵巢、胃和胰腺癌中被发现。在遗传性锯齿状息肉病中，发现了RNF43的胚系突变，并且通过杂合性丢失（LOH）的第二次打击失活也在肿瘤中被发现。此外，在卵巢癌中也报道了野生型RNF43的丢失。这些结果表明RNF43的双击突变在促进肿瘤发生中起作用。

锯齿状肠腺瘤被认为是结直肠癌(CRC)的前体病变。值得注意的是，齿状腺瘤和锯齿状通路型结直肠癌(CRC)中的RNF43突变与BRAF V600E突变和CpG岛甲基化表型（CIMP）相关，导致MLH1启动子的甲基化，这进一步引起微卫星不稳定性（MSI），而不需要DNA错配修复基因突变。此外，在胃、食道和子宫内膜的MSI癌症中也检测到RNF43突变，表明RNF43突变是MSI型癌症的主要驱动因素。更进一步，在Rnf43 -/- 小鼠中，结肠炎相关的结肠肿瘤发展加速，使用Sleeping Beauty转座子的体内筛选确定Rnf43是肠道肿瘤发生的候选驱动因子。综合这些结果表明，由RNF43功能障碍引起的FZD受体水平增加通过Wnt信号激活驱动肠道肿瘤发生，特别是在通过锯齿状通路发展的MSI-结直肠癌(CRC)中。Wnt被棕榈酰化O-酰基转移酶（PORCN）棕榈酰化，这对Wnt分泌是必需的，PORCN抑制剂抑制了RNF43突变结直肠癌(CRC)细胞的生长。与此一致，转化肿瘤遗传性与靶向药物基因解码表明PORCN抑制是针对Wnt配体依赖性癌症的有效治疗策略。

最近的肿瘤遗传性与靶向药物基因解码已经确定了RNF43突变类型与其致瘤潜力之间的联系。然而，关于RNF43突变的遗传信息仍不足以理解结直肠癌(CRC)发展的机制。此外，已经显示37%的Wnt配体依赖性胰腺癌细胞需要外源性Wnt配体，而其他细胞利用内源性Wnt配体。这种细胞类型差异在结直肠癌(CRC)中尚未得到很好的表征。

在本肿瘤遗传性与靶向药物基因解码中，结直肠癌基因检测建立了人类结直肠癌(CRC)来源的类器官，并在CIMP-高/MSI-高结直肠癌(CRC)中发现了RNF43移码突变。重要的是，RNF43突变的类器官依赖于内源性或外源性Wnt配体，PORCN抑制剂显著抑制了类器官增殖和异种移植瘤发生。此外，对亚克隆细胞来源转录本的测序表明，杂合单等位基因RNF43突变驱动结直肠癌(CRC)的发展，而第二次打击突变可能对肿瘤发生有利。

如何进行肿瘤致病基因鉴定基因解码？

全外显子组测序

使用原始类器官细胞（非亚克隆）进行全外显子组测序。使用NucleoSpin Tissue XS（Macherey-Nagel，杜伦，德国）提取基因组DNA。使用SureSelect Human All Exon V6试剂盒（Agilent，弗里蒙特，加利福尼亚州，美国）制备双端文库，并使用Illumina NovaSeq 6000进行测序（外包给Takara Bio，草津，日本）。生成的fastq文件使用DRAGEN Bio-IT平台（Illumina，圣迭戈，加利福尼亚州，美国）映射到人类参考基因组版本GRCh37（hg19）上。检查了APC、CTNNB1、RNF43、ZNRF3、KRAS、BRAF、TGFBR2、ACVR2A和TP53基因中的移码突变、无义突变和已报道的致癌突变。

CIMP分析

使用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen，希尔登，德国）对基因组DNA进行亚硫酸氢钠修饰。通过亚硫酸盐焦磷酸测序分析经典CIMP标记物（MINT1、MINT2、MINT31、MLH1和CDKN2A）和新CIMP标记物（CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3和SOCS1）的DNA甲基化水平，如先前所述。

MSI分析

提取基因组DNA，并根据修订的贝塞斯达指南对两个单核苷酸（BAT25和BAT26）和两个双核苷酸（D2S123和D5S346）微卫星标记物（System Biotics，相模原，日本）进行MSI分析。如果这些标记物中有两个或更多显示不稳定性，则将样本诊断为MSI-高。

RNF43密码子370的基因分型

使用TaqMan SNP基因分型检测（Applied Biosesystems，沃尔瑟姆，马萨诸塞州，美国）检查RNF43密码子370的基因型。野生型RNF43密码子370（VIC）和p.Rpo370fs（FAM）的TaqMan引物和探针序列在补充材料和方法中提供。使用Mx3000P（Stratagene，拉霍亚，加利福尼亚州，美国）的等位基因判别/SNP系统分析PCR结果。合成定制的RNF43 p.Pro370fs cDNA以获得纯合突变对照。

人类基因表达数据库分析

从癌症基因组图谱（TCGA）数据库（https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）下载人类结直肠癌(CRC)表达数据。提取携带APC深度缺失（n = 19）或在密码子659 N端的RNF43移码突变（n = 12）的结直肠癌(CRC)表达数据，并使用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）（Ingenuity Systems，Qiagen；www.ingenuity.com）检查上游调节因子。Z-score ≥2且P值<0.05被认为表示具有统计学意义的激活。

肿瘤致病基因鉴定基因解码如何增加结直肠癌致病及靶向药物基因检测的准确性？

肿瘤的致病基因鉴定基因解码先前的工作已经明确，具有微卫星不稳定性（MSI）的锯齿状息肉更容易发展为结直肠癌（结直肠癌(CRC)）。RNF43突变常见于无蒂锯齿状病变（SSL）和MSI型结直肠癌(CRC)中，表明RNF43突变可能通过锯齿状途径驱动结直肠癌(CRC)发展。结直肠癌基因检测的肿瘤遗传性与靶向药物基因解码发现，在CIMP高和MSI高的结直肠癌(CRC)衍生类器官中存在RNF43移码突变，这些突变与BRAF V600E突变相关。

值得注意的是，RNF43突变型结直肠癌(CRC)中的活性β-catenin水平明显低于APC双击突变结直肠癌(CRC)，且仅在APC突变型结直肠癌(CRC)中观察到β-catenin的核积累。这表明锯齿状途径肿瘤发生的Wnt激活阈值低于常规途径。有肿瘤遗传性与靶向药物基因解码报道，与非超突变结直肠癌(CRC)相比，MSI高超突变结直肠癌(CRC)中的Wnt激活程度显著降低。常规途径中，高水平的Wnt激活可能是形成腺瘤性息肉所必需的初始事件，如在Apc Δ716基因敲除小鼠中观察到的。尽管在Rnf43 −/− Znrf3 −/− 复合突变小鼠肠道中发现了腺瘤性增生，但在Rnf43 −/− 单突变小鼠中未观察到此现象。这些结果暗示RNF43突变诱导的Wnt激活程度可能不足以启动常规型结直肠癌(CRC)，但可以促进锯齿状途径肿瘤发生。

肿瘤遗传性与靶向药物基因解码中，所有RNF43移码突变结直肠癌(CRC)细胞均以R-spondin依赖的方式增殖。这表明可能需要通过R-spondin抑制ZNRF3功能并保留RNF43功能，才能达到RNF43突变细胞中肿瘤发生所需的Wnt信号水平。

先前肿瘤遗传性与靶向药物基因解码报道，卵巢肿瘤和锯齿状结肠肿瘤中存在导致野生型RNF43丢失的LOH或二次体细胞突变，这暗示RNF43可能需要两次突变失活才能发生肿瘤。然而，结直肠癌基因检测的结果显示C14和C24细胞中存在杂合的单等位基因RNF43突变，表明RNF43的双等位基因失活可能不是锯齿状通路肿瘤发展的必要条件。另一方面，结直肠癌基因检测在C45细胞中发现RNF43存在两次双等位基因突变，这提示RNF43的两次突变可能通过增加Wnt激活水平促进结直肠癌(CRC)的发展。此外，结直肠癌基因检测还发现RNF43中p.Pro370fs和p.Gly659fs的顺式突变位于同一等位基因。最近的分析表明，RNF43最常见的突变p.Gly659fs会轻微损害RNF43功能，而N端截断突变在增加Wnt信号活性方面比C端突变更有效。因此，p.Gly659fs突变可能在C14和C24肿瘤发生的早期阶段引入，导致Wnt信号略有增加。随后在相同等位基因处引入另一个N端p.Pro370fs突变，可能通过进一步增加Wnt活性促进肿瘤的发生。

值得注意的是，将RNF43移码突变结直肠癌(CRC)细胞与肌成纤维细胞共移植可增加β-catenin核积累和PDX肿瘤细胞增殖，表明RNF43突变细胞的恶性表型高度依赖于基质细胞。多项肿瘤遗传性与靶向药物基因解码已证实Wnt信号在转移中的作用：Wnt激活通过增加核Smai2表达促进上皮-间质转化，而β-catenin和FOXO3的核积累则加速结肠癌细胞的肝转移。因此，转移性微环境细胞可能通过激活Wnt信号在播散性RNF43突变结直肠癌(CRC)细胞增殖中发挥关键作用。本肿瘤遗传性与靶向药物基因解码证明ETC-159治疗可显著抑制RNF43突变PDX肿瘤。因此，进一步肿瘤遗传性与靶向药物基因解码PORCN抑制剂是否可以抑制RNF43突变细胞转移灶的发展对未来临床策略具有重要意义。

总之，结直肠癌基因检测建立了RNF43移码结直肠癌(CRC)衍生的类器官。肿瘤遗传性与靶向药物基因解码发现，RNF43突变锯齿状通路结直肠癌(CRC)的Wnt/β-catenin活化水平低于常规通路型结直肠癌(CRC)。杂合RNF43移码突变可能通过锯齿状通路促进肿瘤发生，而二次RNF43突变可能通过增加Wnt活化水平进一步促进结直肠癌(CRC)发展。最后，PORCN抑制显著抑制了RNF43突变结直肠癌(CRC)细胞的PDX肿瘤发展，表明PORCN抑制剂可能是针对RNF43突变结直肠癌(CRC)发展和转移的有效治疗策略。

以基因解码为基础的肿瘤遗传性及靶向药物基因检测具有什么样的特点？

基因解码为基础的肿瘤遗传性及靶向药物基因检测增加结直肠癌致病及靶向药物基因检测的准确性和全面性，主要是从以下几个方面考虑:

扩大基因检测范围:

除了传统的APC、KRAS、BRAF等基因外，还应包括:

RNF43、ZNRF3等Wnt信号通路相关基因

MLH1、MSH2等错配修复基因

CIMP相关标记基因如CACNA1G、IGF2等

新发现的驱动基因如TGFBR2、ACVR2A等

采用多组学检测方法:

全外显子组测序:检测编码区突变

全基因组测序:检测大片段缺失、重排等

RNA测序:检测基因融合和表达异常

甲基化测序:检测CIMP状态

蛋白质组学:检测蛋白功能异常

提高检测灵敏度:

使用高深度测序

采用数字PCR等高灵敏度技术

液体活检ctDNA检测

关注基因突变的具体类型和位置:

区分激活突变和失活突变

注意突变的功能域位置

分析突变的等位基因状态(杂合/纯合)

建立综合评分系统:

整合多个基因的突变情况

考虑基因间的相互作用

纳入临床病理特征

开发人工智能算法:

机器学习模型预测致病性

深度学习分析复杂的基因调控网络

建立大规模数据库:

收集更多患者样本数据

整合多中心研究结果

定期更新数据库

重视功能验证:

体外细胞实验验证基因功能

动物模型验证致病机制

临床试验验证靶向药物效果

关注肿瘤异质性:

多区域取样

单细胞测序分析

动态监测肿瘤进展

结合临床信息:

分析基因型-表型相关性

考虑患者个体差异

纳入治疗反应和预后信息

通过以上方法,可以更全面、准确地鉴定结直肠癌致病基因和靶向药物靶点,为精准医疗提供有