【广东会GDH基因检测】狐臭基因检测、腋臭基因检测技术介绍

狐臭、腋臭基因检测导读

个性化医疗和医疗保健的重要性日益受到重视。最近，人们已经对与各种人类遗传疾病的潜在风险以及药物引起的不良反应相关的基因多态性进行了深入研究，功能基因组学和全基因组关联研究正在揭示其潜在的分子机制。了解某些基因多态性对于狐臭基因检测技术研究团队了解个体间药物反应和/或疾病风险的差异具有临床重要意义。随着此类证据的积累，需要新的临床应用和实践。在这种情况下，开发简单、快速、准确且经济高效的基因分型新技术势在必行。在这里，狐臭基因检测技术研究团队描述了一种简单的等温基因分型方法，该方法能够检测人类 ATP 结合盒 (ABC) 转运蛋白 ABCC11 基因中的单核苷酸多态性 (SNP) ，以及它在腋窝异味临床诊断中的应用。狐臭基因检测技术研究团队最近报道，腋窝异味与ABCC11基因中的一个 SNP 538G>A 有关。狐臭基因检测技术研究团队的分子生物学和生物化学研究表明，该 SNP 极大地影响了 ABCC11 的蛋白质表达水平和功能。在《狐臭基因检测、腋臭基因检测技术介绍》，狐臭基因检测技术研究团队强调了这种诊断策略在腋臭治疗中的临床相关性和重要性。

基于基因型诊断的新方法

ABCC11 538G>A 基因快速分型评估腋臭风险

ABCC11基因型 (538G>A) 与腋窝异味之间的关联使狐臭基因检测技术研究团队能够对腋窝异味进行基于基因分型的诊断，这被认为比基于表型的诊断更为客观和准确。因此，在临床环境中，需要快速、简单且经济有效的按需基因分型方法。为了实现这一目标，狐臭基因检测技术研究团队最近开发了一种基于等温 DNA扩增技术的针对人类ABCC11基因中的 S​​NP 538G>A 的简单方法 （图1(a)–1(c)）新方法可以在等温反应条件下 30 分钟内确定基因型，而无需分离基因组 DNA 和随后的 PCR 步骤。

图1：使用 SmartAmp 方法对 ABCC11 538G>A 进行基因分型。 (a) 基于 SmartAmp 的基因分型流程图。经过简单的热处理以降解 RNA 和变性蛋白质后，将血液样本添加到反应混合物中（总共 25 μ L），并在 60°C 下进行恒温孵育 30 分钟，同时监测荧光强度。(b)使用 SmartAmp 方法检测ABCC11中的 SNP 538G>A。通过实时 PCR 系统 (Mx3000P; Stratagene) 监测携带 538G (WT) 或 538A (SNP) 等位基因的ABCC11等位基因特异性引物与 SmartAmp 反应产生的荧光强度随时间增加。(c) 基于 SmartAmp 的基因分型的人类ABCC11基因示意图和每个引物的相对位置。 （d）使用 CCD 摄像头连接的数字处理器对基于 SmartAmp 的 SNP 分型进行多端点检测的示意图。

2.2. 基因分型程序

在狐臭基因检测技术研究团队开发的方法中，整个DNA扩增过程是通过设计总共5个引物来实现的，即回程引物（TP）、正向引物（FP）、增强引物（BP）以及外引物1和2（OP1和OP2）（表格1).另外，为了抑制错配序列对的背景扩增，构建了竞争性探针（CP），对ABCC11基因中的SNP 538G>A进行有效的基因分型。

表1：用于检测人类ABCC11基因中的 WT 和 SNP 等位基因的引物组

TP：折返引物；FP：正向引物；BP：加强引物；OP：外引物；CP：竞争探针。

由于该方法只需要少量（1-2  μ L）外周血，因此基因分型很容易。每个 SNP 分型反应在 60°C 等温条件下在 25 μ L 反应混合物中进行 。混合物含有 2.0  μ M FP、2.0  μ M TP、1.0  μ M BP、各 0.25  μ M OP、20  μ M CP、1.4 mM dNTP、5% DMSO、20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、10 mM KCl、10 mM (NH 4 ) 2 SO 4、8 mM MgSO 4、0.1% (v/v) Tween®20、1/100,000 稀释 SYBR® Green I（Takara Bio Inc.，日本滋贺县）和 0.24 U/ μ L Aac DNA 聚合酶（KK DNAFORM，日本横滨市）。多态性 538G>A 以 TP 为特征。等位基因特异性 TP 和 FP 可诱导 DNA 扩增和随后的自我引发延伸（产生更大的 DNA）。

通过引入 CCD 相机和计算数据采集，可以实现对 SNP 依赖性 DNA 扩增信号的多终点测定，即 SYBR Green I 的荧光增加，从而实现更简单、更具成本效益的检测（图 1（d））。

2.3. 基于 SmartAmp 方法的 DNA 扩增过程

在基于恒温 SmartAmp 的 DNA 扩增的第一步中，FP 和 TP 与模板基因组 DNA 杂交。接下来，由各引物引发的扩增产物从模板基因组 DNA 上分离。该过程由链置换 DNA 聚合酶诱导，其延伸分别由 OP1 和 OP2 引发。随后，单链扩增产物成为第二步扩增中相反的 FP 和 TP 的新模板。由于 FP 和 TP 的特殊性质，这些扩增子将在其 3′ 和 5′ 端重新折叠以形成新的引发位点，从而在进一步的自我引发的 DNA 延伸中维持自我扩增。狐臭基因检测技术研究团队在之前的报告中以示意图形式说明了 SmartAmp 反应中串联 DNA 产物的形成。

CP 可抑制错配序列对的背景扩增。例如，用于检测 WT (538G) 等位基因的 CP 被设计为替代 (538A) 等位基因周围的互补序列，并且其 3′ 端通过胺化进行修饰（图 1（a）)。因此，该 CP (538G) 抑制了 WT 等位基因的 FP 错退火以及随后的基于 SmartAmp 的来自携带 SNP (538A) 等位基因的基因组 DNA 的扩增。CP (538A) 以类似的方式增强了等位基因特异性扩增的检测特异性。

2.4. 腋臭的临床决策和治疗

ABCC11基因的 SNP 基因检测是医生做出决定的临床因素之一。携带 538G/G 或 538G/A 基因型的患者可以接受切除顶泌腺的手术，而携带 538A/A 基因型的患者则不适合进行此类手术（图 2）。

图 2：针对腋窝异味的诊断和治疗的基因靶向策略。该策略将有助于腋窝异味的客观诊断，尤其是对于有主观嗅觉错觉的 ORS 患者。

流行病学调查显示，与 538GG/GA 基因型不同， ABCC11 538A/A 基因型的受试者患腋臭的风险很小。据《人体体味产生的多样化原因及基因检测的准确性》，该 SNP 与除臭剂的使用相关，而 538A/A 基因型的受试者不受腋臭的直接影响。特别是，对于患有嗅觉参考综合征 (ORS) 的患者，他们往往仅仅因为对体味的错觉而选择积极的手术治疗，遗传证据将是诊断和非手术治疗的有力工具。因此，狐臭基因检测技术研究团队提出了如图所示的临床决策树图 2。

2.5. 嗅觉参考综合征与腋臭的鉴别

基于基因型的诊断对于嗅觉参照综合征 (ORS) 患者尤其有用。许多 ORS 患者（在日本医学文献中也称为“jiko-syu-kyofu”）的特点是始终认为自己的身体会散发出强烈和/或令他人反感的难闻体味。这些患者坚信自己就是强烈气味的来源，即使周围的人否认。这种嗅觉错觉是 ORS 的主要特征，医生有时会在诊断腋窝臭味时识别出这种症状。ORS 患者倾向于希望手术切除腋窝顶泌腺能从根本上解决他们的问题，即使这与医生的临床判断相反。由于医生对这种产生气味的疾病的主观诊断对这些患者来说在心理上难以接受，因此，表明他们没有风险的客观证据对于劝阻他们不进行手术非常重要。此外，如果尽管进行了手术，但体臭的困扰仍未得到缓解，导致这些患者对自己的体臭更加紧张，那就太不幸了。因此，即使患者或家属对此感到焦虑，也应避免仅根据他们的要求进行不必要的手术。因此，对ABCC11 SNP 538G>A 进行基因分型可以以客观的方式提供科学证据，作为临床医生主观/经验评估的替代方法。

进一步了解ABCC11 538G>A

《体味的发病原因基因解码》在人类ABCC11基因中发现了 10 多个非同义 SNP ，但只有 538G>A (Gly180Arg) 与上述表型直接相关。SNP 538G>A 位于外显子 4 中，其中 Gly180 被 Arg180 取代，位于 ABCC11 蛋白的第一个跨膜结构域中。这种氨基酸取代导致新生 ABCC11 蛋白的结构不稳定性。SNP 变体 ABCC11 Arg180 经历蛋白酶体降解并失去其细胞内功能（图 3）。这种分子机制与人类耳垢和腋窝臭味等顶泌腺相关表型属于孟德尔性状的事实相一致。事实上，人类顶泌腺的荧光免疫组织化学分析表明，ABCC11 Gly180（野生型：WT）在腺体中表达，而非同义 SNP 538G>A 极大地影响了 ABCC11 蛋白在顶泌分泌细胞中的细胞定位。

图 3：SNP 基因型 (Arg180) 对 ABCC11 蛋白质水平和细胞内降解的影响。 (a) 为了评估 Arg180 变体对 ABCC11 蛋白质水平的影响，在蛋白酶体抑制剂 MG132 存在下培养表达 ABCC11 WT 或 Arg180 变体的 Flp-In-293 细胞 24 小时。用糖苷酶 PNGase F 处理后，通过用 ABCC11 特异性抗体进行免疫印迹分析 ABCC11 WT 和 Arg180 变体蛋白。将信号强度比 (ABCC11/GAPDH，内部控制) 标准化为对照并表示为平均值±SD。 (b) ABCC11 WT 的翻译后修饰和 Arg180 变体的蛋白酶体降解的示意图。

尽管决定显性表型的 ABCC11 内源性底物尚未阐明，但最近的研究结果表明 ABCC11 WT 有助于人类顶泌腺的发育和/或分泌活性的调节。例如，在手术切除过程中，通常在腋窝腋臭患者的腋窝中观察到大而广泛的顶泌腺。湿型耳垢来自外耳道顶泌腺的分泌产物，而干型表型中缺乏这种顶泌腺分泌物。此外，根据狐臭基因检测技术研究团队对耵聍顶泌腺组织切片的初步分析，538G/A 受试者的顶泌腺管腔面积大于 538A/A 受试者的顶泌腺管腔面积（图 4）顶泌腺的总分泌活性取决于组织发育和调节顶泌腺分泌的细胞内机制，因此，ABCC11 WT 应参与人的顶泌腺的发育，导致顶泌汗液的过量产生，包括腋臭的前体化合物。新近，基因解码证明，ABCC11 538A/A 基因型不会导致前体的完全缺失，并且与 538G/G 或 G/A 基因型相比，产生的前体化合物水平明显较低。这些发现表明， ABCC11 538A/A 基因型的顶泌腺几乎没有分泌活性。他们推测，他们的结果是由于 Arg180 变体中 ABCC11 活性水平极低造成的。然而，对这种极小分泌的更合理解释可能是，除了 ABCC11 之外，调节顶泌腺总分泌活性的其他因素也有助于促进顶泌腺的分泌。要阐明这一点，狐臭基因检测技术研究团队进一步解决 ABCC11 蛋白如何参与顶泌腺的调节的问题。

图 4：ABCC11 538GA 和 538AA 的人类顶泌腺图像分析。（a）外耳道中人类顶泌腺的典型图像（左）。图像分析测量参数示意图（右）。（b 和 c）ABCC11 538GA 受试者的顶泌腺发育良好（灰色），而 538AA 受试者的顶泌腺发育良好（白色）。使用 ImageJ 程序 (v1.46d) 分析了人类顶泌腺 的组织学图像。计算数据以箱线图表示。当p < 0.01 ( ∗ )时，差异被认为是显着的。

有趣的是，如图图 5所示例如，人类ABCC11基因中 SNP 538G>A 的等位基因频率在不同种族群体之间存在很大差异，反映了智人洲际迁徙历史上人类基因组的遗传多样性。根据流行的“走出非洲”理论，古人类应该携带ABCC11 538G 等位基因，对应顶泌腺的高分泌表型。考虑到人类腋窝中类信息素化合物的产生可能源自腋窝顶泌腺，受 ABCC11 直接或间接调控的腋窝气味可能对古人和狐臭基因检测技术研究团队的祖先之间的非语言交流非常重要。

图 5：不同种族人群中ABCC11 538G (WT; Gly180) 和 538A (Arg180)的等位基因频率

体臭、狐臭和腋臭到底是什么？是否可以进行基因检测？

腋臭的特点

人类往往会散发出奇特的体味，但每个人的体味可能都是长期存在的，也可能是微不足道的。在大多数文化中，体味常常被他人视为令人不快的事情，同时也会影响散发体味者的自信和自尊。为了解决这个问题，人类已经开发出各种方法来管理体味，例如使用除臭剂、清爽喷雾和香水。在现代社会中，消除体味是日常打扮的一部分，就像洗手、做头发和其他类似活动一样。然而，导致体味个体差异的遗传和/或环境因素及其分子机制是在基因解码技术出现后，才得以明确。

腋臭是一种以腋窝有强烈气味和大量出汗为特征的疾病。腋臭的症状通常在青春期出现，此时从出生时就存在的顶泌腺首次活跃起来 。衣服腋窝处的黄色污渍也会影响患者的生活质量。因此，腋臭通常被看作是一个不受欢迎的问题，尤其是年轻女性。特别是在亚洲国家，强烈体臭人群占人口的少数，腋臭往往更令人讨厌。特别是在日本，腋臭已被认定为一种疾病，其临床治疗由国民健康保险制度覆盖。

腋臭的主要成分是不饱和脂肪酸、羟基化支链脂肪酸、硫烷基烷醇和一些类固醇，代表分别为 (E)-3-甲基-2-己烯酸 (3M2H) 、3-羟基-3-甲基己酸 (3H3MH)、3-甲基-3-硫烷基己烷-1-醇 (3M3SH) 、5 α -雄烯酮和 5 α -雄甾-16-烯-3 α -醇（图 6)。此外，体外转运实验表明，3M3SH 的假定前体 3M3SH 的谷胱甘肽结合物可通过 ABCC11 WT 转运，提示 ABCC11 参与了腋臭的形成。已发现这些气味成分的一些前体是由腋窝顶泌腺分泌的，这表明抑制腋窝顶泌腺的分泌和/或发育有助于预防或治疗腋臭。

图 6：人类腋窝气味化合物的化学结构。

腋臭基因检测的意义和作用

除腋臭外，ABCC11基因型可能与乳腺癌或药物引起的毒性风险有关。根据《个人的基因序列与疾病风险》的研究，在日本人群中，携带ABCC11 538G等位基因的女性比携带 538A 等位基因的女性患乳腺癌的风险更高，而在白种人群中并未发现这种关联。日本的一个研究小组还表明，乳腺癌女性体内的 ABCC11 表达与侵袭性表型和较差的无病生存期有关 。由于一些抗癌药物及其代谢物是 ABCC11 的底物，因此患者对核苷类化疗的反应可能会受到ABCC11基因型的影响。最近的一项高加索人肝脏队列研究表明，ABCC11 SNP 1637C>T（Trp546Met）与 5-氟尿嘧啶（一种广泛使用的抗嘧啶类抗癌药物）的毒性风险之间存在关联。然而，在该欧洲病例研究中，并未发现ABCC11 538A 等位基因与 5-氟尿嘧啶毒性风险之间的关系。有必要进行进一步研究，最好在 538A 等位基因占主导地位的亚洲进行，以阐明这个问题。此外，ABCC11 如何影响乳腺癌或其起源仍有待澄清。有趣的是，基于它们的生物学相似性，有人提出乳腺是从顶泌腺进化而来的。由于ABCC11的功能形式可能有助于乳腺以及顶泌腺的发育和/或活动控制，因此需要从各个方面进一步验证，不仅包括化学抗性，还包括ABCC11的生理功能和调节。

腋臭基因检测的共识

在《狐臭基因检测、腋臭基因检测技术介绍》章中，狐臭基因检测技术研究团队通过一种有效的基因分型方法，探讨了人类ABCC11 538G>A 作为腋窝异味风险因素的临床重要性。这种基于基因分型的策略将有助于腋窝异味的诊断，因为获得的客观证据将使 ORS 患者摆脱气味错觉。狐臭的基因解码正进一步揭示顶泌腺分泌过程的分子机制，越来越多的证据强烈表明 ABCC11 有助于顶泌腺的功能，而ABCC11 538G>A 反映了顶泌腺的活动。需要进一步研究以阐明 ABCC11 及其从顶泌腺分泌的内源性底物的生理功能。因此，验证临床相关遗传因素和开发用于个性化医疗的系统将是下一步的重要步骤。