【广东会GDH基因检测】如何对多发性骨髓瘤的基因序列变化进行基因检测？

多发性骨髓瘤患者样本和 FACS

作为临床常规的一部分，在广东会GDH基因合作医院收集了多发性骨髓瘤患者的骨髓样本。患者材料的收集和使用需获得所在医院伦理审查机构的批准，并根据赫尔辛基宣言进行。为了分析纯化的细胞亚群，细胞使用 FACS ARIA IIu 分选仪 (BD Biosesciences) 进行 FACS。在分选过程采用碘化丙啶 (PI) 排除死细胞。使用 CD319 补偿冷冻保存材料上 CD138 的损失，接受 FACS 的多发性骨髓瘤细胞被分选为为 PI ^- CD14/CD16/CD11b ^- CD3 ^- CD319 ⁺ CD38 ⁺. 此外，CD138、CD19、CD45 和 CD56 用于根据表达定义多发性骨髓瘤细胞。接受 FACS 的粒细胞和 T 细胞的分选标准分别为 PI ^- CD14/CD16/CD11b ⁺ CD3 ^- CD19 ^- CD56 ^- CD319 ^- CD45 ⁺ CD38 ^-和 PI ^- CD14/CD16/CD11b ^- CD3 ⁺ CD19 ^- CD56 ^- CD319 ^- CD45 ⁺ CD38 ^-。

FISH基因检测

使用针对 t(4;14)、t(14;16)、t(11; 14 )、 1q21、4p16、6q21、8p12、9p21、11q13、13q14、13q34、14q32 、 15q22、16q23、17p13 和 19q13的探针进行FISH基因检测。

lrWGS

在制备测序文库时，将 200 至 240 个经过 FACS 处理的细胞分选到 8 μL 含 2% 胎牛血清的磷酸盐缓冲盐水中；将管短暂脉冲旋转，在干冰上冷冻，并储存在-80°C直至使用。为了使细胞变性并使基因组 DNA 易于获取，使用窄孔吸头添加 2 μL 0.25N NaOH，并通过小心轻弹试管来混合样品。在室温下孵育 5 分钟后，将 97.5 μL 样品主混合物（89.5 μL 基因组试剂混合物、3 μL 添加剂 A 和 5 μL 基因组酶混合物；Chromium Genome Reagent Kit [v2 Chemistry]）添加到具有窄孔先进的变性细胞。随后，使用大口径吸头轻轻移液混合样品。将总共​​ 90 μL 的样品混合物（含有约 1.2 ng DNA）加载到 Chromium 基因组芯片上，其余步骤根据产品说明（手册 CG00043 Rev B）执行。使用 Qubit dsDNA HS 试剂盒（Invitrogen）对条形码文库进行量化，合并，并使用 Illumina 平台（Novaseq；Illumina，San Diego，CA）进行配对末端测序（2×150 个循环）。

使用 Long Ranger 处理数据，输出文件用于下游分析。简而言之，染色体数是使用 BarCrawler ( https://github.com/J35P312/BarCrawler ) 结合内部脚本计算的；对于选定样本，还使用 ​​CNVkit (v0.9.8)、 ASCAT (v2.5.2)、和 Battenberg 方法 (v2.2.9)评估了染色体数目；使用 FindSV ( https://github.com/J35P312/FindSV ) 和 Long Ranger 调用 CNV；体细胞变异调用是使用 nf-core/Sarek 分析方案（v2.6 ；使用 Strelka2 [v2.9.10] 和 Mutect2 [GATK v4.1.7.0] 作为获得基因突变位置）和 VEP (v99.2) 和 SnpEff (v4.3t) 的组合用于变体注释；使用 GROC-SV (v0.2.5) 结合 Long Ranger 识别 SV；并在Loupe和 IGV 中目视验证SV。

RNA测序

链特异性 RNA 测序数据是从多发性骨髓瘤细胞生成的。使用 STAR (v2.5.2b) 将测序数据与hg38进行比对，使用 HOMER 量化外显子中的46 个读数，使用 R 计算每百万转录本 (TPM)。

ChipSeq

使用 H3K27Ac 抗体（批次 A1723-0041D/2；目录号 #C15410196；Diagenode）对 20000 个用于FACS的多发性骨髓瘤细胞进行染色质免疫沉淀测序（ChIPseq）。但对对照的制备进行了微小修改。使用 bowtie2 将 Fastq 文件匹配到到hg38，并使用 HOMER、 DEseq2和 R 进行下游分析。