【广东会GDH基因检测】肿瘤靶向药物阿来替尼(Alectinib)使用前基因检测
为什么使用阿来替尼前需要进行靶向药物基因检测?
酪氨酸激酶抑制剂间变性淋巴瘤激酶 (ALK-TKI)(包括阿来替尼)已成为 ALK 融合基因阳性非小细胞肺癌 (NSCLC) 的标准疗法。在 NSCLC 中已发现多种 ALK 融合变异体,主要变异体为棘皮动物微管相关蛋白样 4-ALK (EML4-ALK) 变异体 1 (V1)、V2 和 V3a/b。然而,关于这些变异体对 ALK-TKI 的临床反应的报道存在争议,关于其他不太常见的 ALK 变异体的报道较少。为了检验 ALK 变异体对 ALK-TKI 疗效的影响,肿瘤基因解码基因检测是分析了 8 种 ALK 变异体对阿来替尼的敏感性:3 种主要变异体(V1、V2 和 V3a)和 5 种不太常见的变异体(V4;驱动蛋白家族成员 5-ALK;驱动蛋白轻链 1-ALK;纹状体、钙调蛋白结合蛋白-ALK;和原肌球蛋白受体激酶融合基因-ALK)。使用重组蛋白进行无细胞激酶测定,并使用表达 ALK 变异体的小鼠 Ba/F3 细胞进行细胞生长测定。每种重组蛋白的激酶活性都被阿来替尼显著抑制。在每个表达 ALK 变异体的 Ba/F3 细胞中,阿来替尼抑制了细胞内 ALK 磷酸化水平及其下游信号传导介质 STAT3 和 ERK。每种细胞的增殖均受到阿来替尼治疗的显著抑制。细胞之间的 IC 50值没有显著差异,反应性差异小于 3.6 倍。总之,这八种 ALK 变异体在体外对阿来替尼的敏感性相似,这表明可能无法仅通过确定 ALK 融合阳性 NSCLC 中的 ALK 变异体类型来预测对阿来替尼的反应。
肿瘤靶向药物阿来替尼(Alectinib)使用前基因检测关键词
阿来替尼、ALK、EML4、融合、KIF5B、KLC1、肺癌、STRN、TFG、变异
不同的肺癌患者具有不同的基因突变,可以由肺癌基因检测进行明确
不同的肺癌患者有不同的基因突变,使得它们对靶向药物的敏感性不同。根据《肿瘤靶向药物基因检测》,8% 的非小细胞肺癌 (NSCLC) 患者发生间变性淋巴瘤激酶 (ALK) 基因重排。研究发现,ALK 融合阳性 (ALK+) NSCLC 患者接受 ALK 酪氨酸激酶抑制剂 (ALK-TKI) 治疗后临床结局有所改善,这促使克唑替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布格替尼和劳拉替尼等药物获得批准。在 ALK+ NSCLC 中已发现 90 多种不同的 ALK 融合变体。贼常见的变异是棘皮动物微管相关蛋白样 4 (EML4)-ALK 变异 1 (V1)、变异 2 (V2) 以及变异 3a 和 3b (V3a/b),它们是由 2 号染色体上与 ALK 融合的 EML4 在不同断点处发生倒位引起的;这些变异的发生频率分别为 42.7%、10.5% 和 37.1% 。
在先前的克唑替尼或劳拉替尼临床研究中,V3a/b 患者的无进展生存期 (PFS) 似乎明显短于 V1 患者。然而,这些结果与其他克唑替尼或阿来替尼研究的结果相冲突,这些研究报告称 V1、V2 和 V3a/b 患者的 PFS 差异并不显著。此外,目前可用的临床数据非常有限,无法检查次要罕见 ALK 变异(约占除 V1、V2 和 V3a/b 以外所有变异的 10%)是否影响对 ALK-TKI 的疗效。
在这项临床前研究中,肿瘤靶向药物基因检测分析了阿来替尼对主要 ALK 变异以及次要变异的影响。肿瘤靶向药物基因检测选择了 ALK + NSCLC 中的八种不同的 ALK 融合变异:V1;V2;V3a;EML4-ALK 变异 4 (V4);驱动蛋白家族成员 5 (KIF5B)-ALK;驱动蛋白轻链 1 (KLC1)-ALK;纹状体、钙调蛋白结合蛋白 (STRN)-ALK;和原肌球蛋白受体激酶融合基因 (TFG)-ALK。
阿来替尼抑制细胞内 ALK 变体的激酶活性
为了评估阿来替尼对 ALK 变体细胞内激酶活性的影响,肿瘤基因解码基因检测是通过将含有每种变体的载体单独转染到小鼠 Ba/F3 细胞系中,建立了八种稳定细胞,每种细胞表达八种 ALK 变体中的一种。肿瘤基因解码基因检测是还通过转染空载体建立了稳定的对照细胞。由于载体中的新霉素抗性基因也由细胞中的组成型启动子持续转录,因此新霉素抗性基因的 mRNA 表达水平被认为是估计转染后每个 Ba/F3 细胞中载体和 ALK 变体基因拷贝数的良好标记。九种细胞之间的新霉素抗性基因 mRNA 水平差异不显著,表明每种 ALK 变体的 mRNA 表达水平也几乎相同。在所有八种 ALK 变体细胞中,阿来替尼均抑制了细胞内 ALK 变体及其下游信号传导介质 STAT3 和 ERK 的磷酸化水平。此外,ULK1的Ser757磷酸化受到抑制,并且所有变异细胞中的MCL-1蛋白水平均被阿来替尼下调。ULK1 Ser757 磷酸化降低促进自噬,MCL-1 是抗凋亡的 Bcl-2 家族成员之一,这表明阿来替尼可在每种变异细胞中诱导自噬起始和凋亡,无论 ALK 变异类型如何。因此,不仅主要 ALK 变异体 V1、V2 和 V3a,而且次要变异体 V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 和 TFG-ALK 都具有组成性激酶活性,从而通过 STAT3、ERK 或 ULK1 激活下游致癌信号传导。然而,无论 ALK 变异类型如何,阿来替尼都可以通过抑制 ALK 磷酸化来抑制这些信号通路。
阿来替尼抑制 ALK 变异细胞的增殖
贼后,肿瘤基因解码基因检测是研究了阿来替尼对表达 ALK 变体的 Ba/F3 细胞生长的影响。阿来替尼治疗 4 天后,这些表达 ALK 变体的细胞的增殖以剂量依赖性方式显著受到抑制,它们的IC 50值没有显著差异,响应性差异<3.6倍。在贼大剂量1000 nM阿来替尼下,对照细胞的增殖抑制率不足40%。肿瘤基因解码基因检测是通过使用双荧光染料染色吖啶橙和 DAPI 直接计数活细胞和非活细胞的数量来研究细胞死亡。用 10 nM 的阿来替尼处理 4 天后,所有变体细胞的细胞死亡率没有显著差异。与阿来替尼一样,克唑替尼治疗 4 天也以剂量依赖性方式显著抑制每种 ALK 变体的细胞增殖, 且它们之间的IC 50值没有显著差异。接下来,肿瘤基因解码基因检测是研究了在半固体琼脂培养基中用阿来替尼预处理 24 小时对 6 天培养中菌落形成的影响。V1、V2、V4、KLC1-ALK、STRN-ALK 变体细胞的每个菌落均被用阿来替尼预处理有效阻断。无论是否接受阿来替尼预处理,V3a、KIF5B-ALK、TFG-ALK 变异细胞中均无菌落。这些结果表明,无论 ALK 变异类型如何,所有八种 ALK 变异表达细胞的细胞生长均会立即受到 ALK-TKI 治疗的抑制,且抑制效果相似。
阿来替尼抑制对具有特定基因突变的肿瘤细胞的使用效果总结
肿瘤基因解码基因检测是发现 ALK 融合变体的类型(V1、V2、V3a、V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 或 TFG-ALK)不会影响 ALK 变体转化的 Ba/F3 细胞的阿来替尼敏感性,IC 50值表明所有变体之间的反应性差异并不显著,<3.6 倍。
先前有两项研究使用细胞增殖测定法对与肿瘤基因解码基因检测是研究相同的 Ba/F3 细胞进行研究,但结果不一致。Heuckmann等人报道,表达 V3a 的细胞的 IC 50比表达 V2 的细胞高 6.7 倍以上 ;Woo等人报道,表达 V3a 的细胞的 IC 50比表达 V1 或 V2 的细胞高 11.8 倍以上,这表明表达 V3a 的细胞对阿来替尼的耐药性比表达 V1 或 V2 的细胞更强。虽然造成这种矛盾的具体原因尚不清楚,但考虑到据报道ALK融合基因的扩增会在 ALK + H2228 细胞中诱导克唑替尼耐药性,结果可能受到每种 ALK 变体基因表达水平差异的影响。此外,V1、V2 和 V3a 变体之间的周转率以及细胞内 ALK 融合蛋白的不稳定性也可能存在显著差异。
因此,为了更正确地阐明阿来替尼敏感性的差异,肿瘤基因解码基因检测是认为不仅需要调整每种 ALK 变体蛋白的水平,还需要调整所有八种 ALK 变体表达细胞的基因表达水平。在本研究中,肿瘤基因解码基因检测是同时将每种变体电穿孔到 Ba/F3 细胞中,并成功制备了八种 ALK 变体表达细胞,通过测量新霉素抗性基因的表达来估计,它们之间每种 ALK 变体基因的表达量没有显著差异。如果每种变体的表达水平严重不平衡,则可能推断出高表达的变体对阿来替尼的敏感性低于低表达的变体,无论 ALK 变体的类型如何。这一假设可能部分解释了他们的结果与肿瘤基因解码基因检测是在 V1、V2 和 V3 对阿来替尼的反应方面的不一致。然而,肿瘤基因解码基因检测是的体外模型结果显示,V1、V2 和 V3a 等 8 种 ALK 变异体对阿来替尼的敏感性无显著差异,这与贼近一项阿来替尼一线治疗的 III 期试验中观察到的临床反应一致,该试验发现 V1、V2 或 V3a/b 变异体患者之间的客观缓解率没有显著差异。
在ALK+ NSCLC患者中,已鉴定出近90种ALK融合变异体,除主要的V1、V2和V3a/b变异体之外,几乎所有变异体对艾乐替尼的临床反应尚不清楚。约17%的ALK+ NSCLC患者对艾乐替尼无反应,其反应不佳的原因也不明。在目前的临床前研究中,不仅三种主要变异体对艾乐替尼或克唑替尼敏感性无显著影响,五种不常见变异体(V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK和TFG-ALK)对艾乐替尼或克唑替尼敏感性亦无显著影响。因此,这五种变异至少可能不会导致 ALK + NSCLC 患者对阿来替尼的临床反应出现任何差异,并且在肿瘤基因解码基因检测是推测临床反应和 ALK 变异之间的任何相关性之前,还需要对除此处测试的八种类型之外的各种 ALK 变异表达细胞进行进一步研究。
肿瘤基因解码基因检测是的研究有几个局限性。首先,ALK 变体的数量有限。由于实验上很难建立大量表达几乎等同的 ALK 变体的 Ba/F3 细胞,因此肿瘤基因解码基因检测是在本研究中选择了八种 ALK 变体。其次,肿瘤基因解码基因检测是没有直接测量细胞中的 ALK 变体基因表达,因为每种 ALK 变体 mRNA 的稳定性未知。然而,由相同组成型启动子驱动的新霉素抗性基因存在于八个 ALK 变体载体中的每一个中。因此,肿瘤基因解码基因检测是通过测量常见新霉素抗性基因的表达水平间接衡量了每个 ALK 变体基因的表达。第三,肿瘤基因解码基因检测是用小鼠细胞系 Ba/F3 而非人类细胞系构建了表达 ALK 变体的细胞,尽管肿瘤基因解码基因检测是认为 Ba/F3 细胞适合本研究,因为它们已在之前的研究中用于检查融合基因激酶活性,例如 ALK 或 ROS1 或 RET。为了克服这些限制,并在体外绘制出所有 ALK 融合变体对阿来替尼敏感性的完整图谱,使用 Ba/F3 细胞和人肺上皮 BEAS-2B 细胞测试尽可能多的 ALK 变体将会很有用。
总之,八种 ALK 变异体(V1、V2、V3、V4、KIF5B-ALK、KLC1-ALK、STRN-ALK 和 TFG-ALK)的激酶活性被阿来替尼显著抑制,表达每种变异体的细胞对阿来替尼治疗的敏感性没有显著差异。肿瘤基因解码基因检测是的研究结果表明,无论 ALK 变异体的类型如何,携带这八种 ALK 融合变异体之一的 NSCLC 患者对阿来替尼的反应也可能相似,并且这些变异体的差异可能对 ALK 融合阳性 NSCLC 患者的阿来替尼反应影响不大。此外,由于临床上仅检测到非常有限数量的罕见 ALK 融合变异体,肿瘤基因解码基因检测是在本研究中构建的临床前模型可能是研究这些次要变异体对阿来替尼治疗的临床反应的有用工具。
(责任编辑:广东会GDH基因)